今天带大家走入核酸检测的常用方法PCR方法,以及如何在PCR检测过程中降低检测结果假阴性概率。
一、什么是PCR技术?
PCR技术又称为聚合酶链式反应。是一种用于放大扩增特定的DNA的片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的大特点是能将微量的DNA大幅增加。
在病毒检测中,核酸检测被定义为临床诊断的金标准,RT-PCR技术被反复提到,它是一种将RNA反转录和PCR相结合的技术。首先在反转录酶.的作用下,将提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下不断扩增(变性-退火-延伸多个循环)合成目的片段并进行分析。
二、PCR用水
PCR技术目前多搭配试剂盒使用,也有用户自行制备反应体系,无论哪个过程都需要使用水。无论是近年来季节性爆发的甲流乙流,还是目前都在经历的病毒,在检测过程中都涉及一个痛点,那就是如何尽可能提高核酸检测的准确性,减少假.阴性结果出现的可能性。
我们首先分析一下假阴性结果出现的原因,以病毒核酸检测为例,假阴性的主要原因有:
1病人病程:不同病程,患者体内病毒载量不同;
2采样部位:咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等不同采样部位病毒载量均不同;
3采样准确性:拭子质量,工作人员操作等;
4试剂盒的质量:引物设计以及水质控制。
为了顺利将提取到的RNA反转录并实现DNA的成功扩增,必须抑制核糖核酸酶(RNases)的降解作用,如果试剂盒用水内含RNases,将极有可能导致假阴性结果的出现。
三、去除RNases的主要方法
1高压灭菌:即便是在180°C下高压灭菌4h之后,RNases仍保持某些活性,且某些细菌失活会释放更多的RNases;
2 DEPC法(二乙基焦碳酸酯处理法) :利用二乙基焦碳酸酯(DEPC) 处理方法使酶失活是用来抑制水溶液中RNases活性的常见方法。然而,二乙基焦碳酸酯是一种可疑致癌物,处理须小心;同时该方法虽然能够使酶失活,却无法将其从水中去除,同时清除多余的DEPC过程中,会产生乙醇,二氧化碳等其他污染物;
3超滤法:超滤是一种真正能够从水溶液中清除RNases的方法。
四、超滤膜介绍
超滤膜被大量用于水处理工程。超滤技术在反渗透预处理、饮用水处理、中水回用等领域发挥着越来越重要的作用。超滤技术在酒类和饮料的除菌与除浊,药品的除热原以及食品及制药物浓缩过程中均起到关键作用。
超滤过滤孔径和截留分子量的范围一直以来定义较为模糊,一般认为超滤膜的过滤孔径为0.001-0.1微米,截留分子量(Molecular weigh cut-off, MWCO)为1,000-1,000,000 Dalton。严格意义上来说超滤膜的过滤孔径为0.001-0.01微米,截留分子量为1,000-300,000 Dalton。若过滤孔径大于0.01微米,或截留分子量大于300,000 Dalton的微孔膜就应该定义为微滤膜或精滤膜。
一般用于水处理的超滤膜标称截留分子量为30,000-300,000 Dalton,而截留分子量为6,000-30,000 Dalton 的超滤膜大多用于物料的分离、浓缩、除菌和除热源等领域。
五、超纯水机推荐
(ZYPTF落地式+压力桶 +软水器)
产品说明:
ZYPFT系列超级微量型超纯水器是新一代秉承“人性化设计、高定位标准”研发生产的超纯水机,将城市自来水纯化为符合国标GB/T6682-2008的实验室一级和三级超高纯度实验室用水,基于PLC全自动控制及ARM系列单片机和触摸屏技术的人机界面,实现图形显示制水流程,流量监控耗材更换功能,定时定质取水功能,历史数据查询功能等多项技术,专业适用于科研分析等高要求实验项目。
技术指标:
机型 | 型 | I型 | II型 | C型 | ||
台上式(T) | ZYPFT-I-10/20T | ZYPFT-II-10/20T | ZYPFT-C-10/20T | |||
落地式(L) | ZYPFT-I-20/40/60/100L | ZYPFT-II-20/40/60/100L | ZYPFT-C-20/40/60/100L | |||
进水水源 | 总溶解性固形物含量TDS<200ppm,水压1.0-5.0kg/cm2 工作水温25℃ | |||||
制水量 | 10/20/40/60/100升/小时 | |||||
出水流速 | 1.5-2.0升/分钟(水箱储水时) | |||||
RO出水水质(μS/cm) | 电导率<5μS/cm(在线监测),污染物去除率99.5% | |||||
UP出水水质(MΩ.cm) | 电阻率18 .25MΩ.cm(在线监测) 微颗粒物(0.1um)<1个/ml、微生物<0.1cfu/ml、重金属离子<0.1ppb、可溶性硅(以sio2计)<0.01mg/L 吸光度(254nm,1cm光程:≤0.001 可氧化物质[以(0)计,㎎/L]: ≤0.08 阳离子含量≤0.1ppb (铁(Fe)<0.005ppb ,铜(Cu)<0.005ppb ,钾(K)<0.02 ppb,铝(Al)<0.005ppb,锌(Zn)<0.02ppb , 铬(Cr)<0.005ppb , 钠 (Na)<0.01ppb); 阴离子含量≤0.1ppb(氯(Cl)<0.01ppb, 亚硝酸根(NO)<0.02ppb, 硝酸根(NO)<0.02ppb, 硫酸根(SO)<0.01ppb); | |||||
选型配置 | 触摸屏+MF终端微滤+UV紫外灯 | 触摸屏+MF+UV+UF超滤 | 双显表+MF终端微滤+UV紫外灯 | |||
总有机碳TOC | (TOC)<3ppb | (TOC)<3ppb | (TOC)<3ppb | |||
热源(内毒素) | --------------- | ≤ 0.001EU/ml | --------------- | |||
(ZYPTF台上式+无菌水箱)